1 标本的采取和保存
可用作elisa测定的标本十分广泛，体液(如血清)、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液、粪便)等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定(如血清、尿液)，有些则需经预处理(如粪便和某些分泌物)。大部分elisa检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在elisa中血浆和血清可同等应用。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以hrp为标记的elisa测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。
血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性hrp，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法elisa中可使本底加深。一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。
2 试剂的准备
按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。elisa中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用ph计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。
3 加样
在elisa中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在leisa板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。
加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定(如间接法elisa)需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。
4 保温
在elisa中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)，有人称之为孵育，在elisa中似不恰当。
elisa属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有zui贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么elisa反应总是需要一定时间的温育。
温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃(冰箱温度)等。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立elisa方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2小时，产物的生成可达。为加速反应，可提高反应的温度，有些试验在43℃进行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应4℃更为*，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜，以形成zui多的沉淀。但因所需时间太长，在elisa中一般不予采用。
保温的方式除有的elisa仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴，可将elisa板置于水浴箱中，elisa板底应贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。若用保温箱，elisa板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，zui后将elisa板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度，特别是在气温较低的时候更应如此。无论是水浴还是湿盒温育，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20-25℃，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。室温温育时，elisa板只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。
5 洗涤
洗涤在elisa过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。elsia就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在elisa操作中，洗涤是zui主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。
洗涤的方式除某些elisa仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种，过程如下：
(1)浸泡式 a.吸干或甩干孔内反应液；b.用洗涤液过洗一遍(将洗涤液注满板孔后，即甩去)；c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；d.吸干孔内液体。吸干应*，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；e.重复操作c和d，洗涤3-4次(或按说明规定)。在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。
微量滴定板多采用浸泡式洗涤法。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。
(2)流水冲洗式 流水冲洗法zui初用于小珠载体的洗涤，洗涤液仅为蒸馏水甚至可用自来水。洗涤时附接一特殊装置，使小珠在流水冲击下不断地滚动淋洗，持续冲洗2分钟后，吸干液体，再用蒸馏水浸泡2分钟，吸干即可。浸泡式犹如盆浴，流水冲洗式则好比淋浴，其洗涤效果更为*，且也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样也适用于微量滴定板的洗涤。洗涤时设法加大水流量或加大水压，让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。